Browsing by Author "Sipahioğlu, Hikmet Murat"

Now showing 1 - 2 of 2

Sensitive Detection of Prunus Necrotic Ringspot Virus (PNRSV) by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and Comparison of the Sensitiveness With ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Test
(2004) Usta, Mustafa; Sipahioğlu, Hikmet Murat
İki farklı teşhis yönteminin (DAS-ELISA ve RT-PCR) odunsu konukçu Prunus mahalefe transfer edilen Malatya izolatı Prunus necrotic ringspot virüsünü (PNRSV) teşhisindeki başansının karşılaştırmalı analizi gerçekleştirilmiştir. RT- PCR testi için total RNA ekstraksiyonu, silika temelli metoda göre taze yaprak, kök, kabuk ve yeşil sürgün kabuğu dokuları kullanarak gerçekleştirilmiştir. Saflaştınlan RNA, reverz transkripsiyonda cDNA sentezi için kalıp olarak kullanılmıştır. İki farklı primer seti kullanılarak gerçekleştirilen RT-PCR testi sonrasında 616 bp ve 785 bp uzunluğunda çoğaltılan PCR ürünleri, agaroz jel'de koşulmuş ve ethidium bromid ile boyanarak gözlemlenmiştir. ELISA testi ile karşılaştırıldığında PNRSV izolaunı tamda RT-PCR'm daha duyarlı olduğu saptanmıştır. PNRSV izolatmı RT- PCR ile tamda, kullanılacak en iyi dokuyu belirlemek için yapılan çalışmada kök, kabuk ve yeşil sürgün kabuğu dokularına nazaran yaprak dokusunun PNRSV'yi saptamada en iyi bitkisel doku olduğu tespit edilmiştir. PNRSV virüsünün RT-PCR ile tanısında PCR bileşenlerinin reaksiyona olan etkileri araştırılmış ve herbir bileşen için optimum konsantrasyonlar veya miktarlar tespit edilmiştir. Elli mikrolitte hacminde gerçekleştirilen PCR reaksiyonunda en iyi magnezyum kloriir konsantrasyonun 1.25-2.5 mM aralığında, en iyi dNTP konsantrasyonun 1-10 mM aralığında, en iyi Taq DNA polimeraz enzim konsantrasyonun 0.0625-2 ünite/ul aralığında, en iyi primer konsantrasyonun ise 0.2-0.0002 pmol/ul aralığında olduğu tespit edilmiştir. Aynı hacimde gerçekleştirilen PCR reaksiyonunda en iyi cDNA miktarının 1.6-4 ul aralığında olduğu saptanmıştır. PNRSV virüsünün RT-PCR yöntemi ile tanısında elde edilen optimize bileşen konsantrasyonları iklim odası ve arazi koşullarında gelişen infekteli bitkilere uygulandığında virüsün rahat ve güvenilir biçimde tanısının yapılabileceği tespit edilmiştir. Anahtar kelimeler: PNRSV, RT-PCR, DAS-ELISA, karşılaştırma, optimizasyon
The Survey of Some Wheat Viruses in Wheat Production Fields in Eastern Anatolia by Multiplex RT-PCR Method and the Molecular Characterization of Virus Isolates
(2013) Usta, Mustafa; Sipahioğlu, Hikmet Murat
Doğu Anadolu Bölgesi buğday alanlarında Arpa sarı cücelik virüsleri (Barley/Cereal yellow dwarf viruses: BYDV-PAV, BYDV-MAV, BYDV-SGV, BYDV-RMV ve CYDV-RPV), Buğday çizgi mozaik virüs (Wheat streak mosaic virus, WSMV) ve Toprak kaynaklı buğday mozaik virüslerini (Soilborne wheat mosaic virus, SBWMV) belirlemek amacı ile 2012 yılında survey çalışmaları yürütülmüştür. BYDV (PAV, MAV, SGV, RMV) ve CYDV-RPV'nin varlığını araştırmak için multipleks RT-PCR yöntemi, WSMV ve SBWMV'nin varlığını araştırmak üzere RT-PCR yöntemi kullanılmıştır. Çalışma ile aynı zamanda SBWMV'nin protozoa vektörü olarak bilinen Polymixia graminis PCR yöntemi ile araştırılmıştır. Bölgede varlığı tespit edilen virüslerin kılıf protein genlerinin moleküler karakterizasyonları da gerçekleştirilmiştir. Bölgedeki buğday tarlalarından rastgele 900 adet buğday yaprak örneği ve 78 toprak örneği toplanmıştır. Toprak örneklerindeki protozoa vektörü, tuzak bitki yöntemi ile buğday bitkileri yetiştirilerek araştırılmıştır. Testlenen 900 buğday örneğinden 50'sinin BYDV-PAV (% 5.5), 44'nün BYDV-SGV (% 4.8), 4'nün CYDV-RPV (% 0.4) ve 8'inin ise WSMV (% 0.8) ile bulaşık oldukları tespit edilmiştir. Yürütülen testler sonucunda toplanan buğday yaprak örneklerinde SBWMV, toprak örneklerinde ise vektörü P. graminis tespit edilmemiştir. Tespit edilen her virüs türünden birer izolat seçilerek kılıf protein genleri karakterize edilmiştir. BYDV-PAV (Gen bankası Ulaşım No. KC900900), CYDV-RPV (Gen bankası Ulaşım No. KC900903) ve WSMV (Gen bankası Ulaşım No. KC900901) virüslerinin kılıf protein genlerinin tamamı ve BYDV-SGV (Gen bankası Ulaşım No. KC900899) virüsünün ise kılıf protein geninin bir kısmı klonlanarak üniversal primerler ile DNA dizilemeleri gerçekleştirilmiştir. BYDV-PAV Van izolatının dünyadaki 19 farklı izolatın nükleik asitleri ile % 82-% 94.2 arasında ve amino asitleri ile % 73.5-% 93 arasında değişen oranlarda benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. CYDV-RPV Van izolatı nükleik asit düzeyinde dünya izolatları ile % 83-95.7 arasında BYDV-SGV Van izolatı % 69.1-% 98 arasında WSMV Malatya izolatı ise % 88.5-%97 arasında benzerlik gösterdikleri belirlenmiştir. Bu çalışma ile BYDV-PAV, BYDV-SGV, CYDV-RPV ve WSMV virüsleri Doğu Anadolu Bölgesi'ndeki buğday alanlarında ilk defa rapor edilmiştir.