Purification and Characterization Cf Carbonic Anhydrase (e.c.4.2.1.1.) Enzyme From Van Cat's Erythrocytes

Abstract

Bu çalışmada Van Kedisi eritrositlerinden karbonik anhidraz (E.C.4.2.1.1.)enzimi afinite kromatografisi yöntemi ile saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Buçalışma için alınan kedi kanı, antikoagulantlı tüplere konuldu. Gerekli santrifüj vediğer işlemler yapıldıktan sonra kolona uygulanacak hemolizat haline getirildi.Kolona uygulanacak hemolizatın pH'sı katı Tris ile dengeleme tamponunun pH'sıolan pH=8.7'ye ayarlandı. PH'sı ayarlanmış hemolizat aktifleşmiş Sepharose 4-B-L-tirozin-sülfanilamid afinite kolonuna uygulandı. Kolondan alınan fraksiyonlardanaktivite gösterenler, kantitatif protein tayinleri için Coomassie blue yöntemiyle ve 595nm'de yapıldı. Bunun yanı sıra enzimin optimum pH'sı, optimum sıcaklığı ve iyonikşiddet etkisi incelendi. Sonra SDS-Page Jel elektroforezi ile enzimin saflığı kontroledildi. Enzimin optimum pH'sı 8.0, optimum sıcaklığı 40 oC olarak bulundu. İyonikşiddetin etkisi üzerine yapılan çalışmada ise en yüksek aktivite 0.12 M (NH4)2SO4konsantrasyonunda görülmüştür.Enzimin saflık derecesi SDS-Page Jel elektroforezi ile kontrol edildi ve tekbant görülerek saflığı ispatlandı.

In this study, carbonic anhydrase (E.C.4.2.1.1.) enzyme obtained from VanCat?s erythrocyte was purified with affinity chromatography and characterized. Cat?sblood was put in anticoagulant tubes for this study. After necessary centrifuge andother operations it was converted hemolysate for column application. pH ofhemolysate was adjusted pH= 8.7 which is pH of balancing buffer with solid Tris.The hemolysate was applied to activated Sepharose 4B-Tyrosine-Sulpanilamideaffinity column. Quantitative protein analyse of active fractions was performed at 595nm with Coomassie blue method. In addition, optimum pH of enzyme, optimumtemperature and ionic strength effect was investigated. Then purification of enzymewas controlled with SDS-PAGE electrophoresis. Optimum pH of enzyme andoptimum temperature was found as 8.0 and 40 oC. The highest activity was seen inconcentration of 0.12 M (NH4)2SO4 as ionic strength.Purification of enzyme is controlled with SDS-PAGE electrophoresis andsingle band was seen as an evidence.