Survival of Mouse Spinal Motoneurons in Vitro

Abstract

Sinir hücrelerini in vitro yaşatmak oldukça güçtür ve motor nöron hücresi için bu daha da güçtür. Literatüre bakıldığında kültürdeki motor nöronlar için 24 saat yaşam bildirilmiştir. Bu çalışmada, motor sinir hücrelerini daha iyi tanımlamak ve uzun süreli çalışmalar yapmak üzere kültürdeki motor nöron ömrünü uzatmayı amaçladık. Yetişkin fare spinal kordundan ayrıştırılan motor nöronların serum, faktör ve doku ekstraktı olmadan kültürünü yaptık. İnkübasyondan önce kültürdeki motor nöronları 3 gün boyunca + 4 °C soğukta beklettik ki bu literatürde olmayan yeni bir metodtur. Bunun ardından 37 °C'de bir inkübatöre alındıktan sonra ortalama 6-7 gün daha yaşadılar. Geliştirdikleri uzantıları ve hücrelerin kimliklerini immünositokimya ile tanımlamak için kolin asetil transferaz, periferin, p75, kalsitonin gen ilişkili peptid spesifik marker'leri kullandık. Soğukta bekletme sırasında yeni bir protein sentezi mi oluyor sorusuna bir cevap vermek için transkripsiyon (DRB) ve translasyon inhibitörleri (ANI) ile deneyler yaptık. Sonuçlar hücreleri soğukta uyutma sırasında hayatta kalmayı destekleyecek bazı yeni proteinlerin sentezlendiğini düşündürdü. Ayrıca kültürdeki motor nöronların hayatiyetlerine olan etkilerini değerlendirmek için kültür vasatına değişik faktörler (FGF-2, LIF, EGF, NGF, BDNF) ve normalden daha fazla L-glutamin (% 25 fazla) ekledik. FGF-2 ve fazladan glutamin takviyesi hücrelerin canlılık oranını ve kültürdeki yaşam süresini anlamlı derecede arttırdı. LIF'in benzer ancak daha zayıf pozitif bir etkisi gözlenirken, diğer faktörlerin olumsuz etkiye sahip oldukları gözlendi. Sonuç olarak geliştirdiğimiz bu yeni kültür metodunda, fare spinal ön yarısından elde ettiğimiz motor nöronları ortalama 10 gün yaşatmayı başardık.Anahtar Kelimeler: Spinal motor nöron, kültür, erişkin, soğuk, yaşamIt is very difficult to keep neuron cells alive in vitro and it is even more difficult for motoneurons. In the literature a maximum of 24 hours survival is reported for cultured adult motoneurons. İn this study, we aimed to enhance the motoneuron survival in culture to be able use them for long term studies. The motoneurons dissociated from spinal cord of adult mouse were cultured without serum, factor and tissue extract. Before incubation we kept culture motoneurons in cold at + 4 °C for 3 days which is a new method. After this, they were transferred to an incubator at 37 °C where they lived 6-7 days more. To identify the cells and their growing neurites with immunocytochemistry, we used choline asetil trasferaz, peripherin, p75, calcitonin gen related peptid as specific markers. To give an answer to the question of whether new protein synthesis occurs in cold, we did experiments with transcription (DRB) and translation inhibitors (ANI). Results indicated that some new survival enhancing proteins are synthesized when we kep the cells in cold. We added different factors (FGF-2, LIF, EGF, NGF, BDNF) and extra L-glutamin (% 25 more) to the culture medium and we evaluated their affects on the motoneuron viability. FGF-2 and extra glutamin significiantly enhanced the survival rate and duration in culture. While LIF also had a possitive effect, other factors were detrimental for the cells. In conclusion, in this new culture method, we managed to keep the motoneurons isolated from the anterior half of the spinal cord alive up to ten days.Key words: Spinal motoneuron, culture, adult, cold, survival