Reverse Transkriptase Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Rt-pcr) Tekniğini Kullanarak Doğu Anadolu Bölgesinde Sert Çekirdekli Meyvelerde Tespit Edilen Virüs İzolatlarının Hassas Teşhislerinin Yapılması

Abstract

Sert çekirdekli meyvelerde zararlı Apple chlorotic leaf spot (ACLSV) ve Prunus necrotic ring spot (PNRSV) virüs izolatlarının hassas teşhisleri RT-PCR tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. ACLSV ve PNRSV izolatlarının teşhisinde kullanılan ekstraksiyon yöntemi viral etmenlerin RT-PCR ile teşhisinde yeterli düzeyde ssRNA (tek iplikli RNA) ekstraksiyonu sağlamıştır. Total nükleik asit ekstraksiyonu sonucunda fotometrik ölçüm sonucu PNRSV ve ACLSV virüsleri ile infekteli bitkilerden elde edilen ssRNA konsantrasyonu sırasıyla 0.036 p.g/ju.1 ve 0.028|ig/|ul olarak tespit edilmiştir. RT-PCR sonrası teşhisleri yapılan virüslere ait beklenen uzunluktaki DNA fragmentleri agaroz jelde gözlemlenmiştir. Çalışmada kullanılan teşhis tekniklerinden ELISA ve PCR yöntemlerinin PNRSV izolatını infekteli bitkinin yaprak dokusundan tespit etmedeki başarısı araştırılmış, RT-PCR tekniğinin PNRSV'yi yaprak dokusundan tespit etmede daha etkin ve hassas olduğu belirlenmiştir. RT-PCR yöntemi ile 1/2560 sulandırma oranındaki yaprak dokusundan virüs rahatlıkla tespit edilirken ELISA testinde bu oran iki saat okuma sonucunda 1/80 olarak belirlenmiştir. PNRSV'yi RT-PCR yöntemi ile teşhiste kullanılabilecek en iyi bitkisel dokunun yaprak dokusu olduğu tespit edilmiştir. Yaprak dokusunu sırasıyla yeşil sürgün kabuğu dokusu ve eşit düzeyde pozitif sonuç veren kök ve kabuk dokuları izlemiştir. Teknik olarak virüsün bitkinin bütün dokulardan PCR yöntemi ile tespit edilebileceği görülmüştür. ACLSV virüsünü dormant Purunus pers/ca'nın kabuk dokusundan ELISA ve RT-PCR testleri ile kış döneminde saptanmasının mümkün olduğu belirlenmiş ancak ELISA testinin güvenilirlik sınırlarının dormant kabuk dokusu kullanılınca RT-PCR tekniğine nazaran oldukça düşük olduğu belirlenmiştir. ACLSV virüsünün dormant Purunus pers/ca'nın kabuk ve tomurcuk dokularından hazırlanan ekstraktlardan RT-PCR yöntemi ile her iki dokunun da virüsü belirlemede ideal olduğu saptanmıştır.