Purification, Characterization of 6-Phosphogluconate Dehydrogenase (ec 1.1.1.44; 6pgd) From Lake Van Fish Liver by Affinity Chromatography

Abstract

Bu çalışmada Van Gölü balığı karaciğeri 6-fosfoglukonat dehidrogenaz (EC 1.1.1.44; 6PGD) enzimi afinite kromatografisi metoduyla saflaştırıldı. Bu çalışmada önce balık karaciğeri uygun bir şekilde alınarak homojenat hazırlandı. Hazırlanan homojenat dengeleme tamponu ile dengelenen afinite kolonuna tatbik edildi. Kolon, absorbans değeri 0,01 nm'den küçük olana kadar yıkama tamponu ile yıkandı. Son olarak kolona elüsyon tamponu tatbik edilerek ayrılan enzim fraksiyonları elüsyonlar halinde alındı. Her bir elüsyonun 280 nm'de kalitatif protein tayinleri, 595 nm'de kantitatif protein tayinleri ve 340 nm'de aktivite tayinleri yapıldı. Enzimin saflığını kontrol etmek için Sodyumdodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) metodu kullanıldı. Elektroforez jelinin fotoğrafı çekildi ve tek protein bandı görüldü. Saflaştırma oranı 446.5-kat olarak hesaplandı. SDS-PAGE ile enzimin alt biriminin molekül ağırlığı 57 kDa olarak belirlendi. Enzimin optimum sıcaklığı ve optimum pH'si sırasıyla 35-40 OC, 8-9 aralığında bulundu. İyonik şiddet etkisinin araştırıldığı bu çalışmada enzimin maksimum aktivite gösterdiği tuz [(NH4)2SO4] konsantrasyonu 0.02 M olarak bulundu.

In this study 6-phosphogluconate dehydrogenase (EC 1.1.1.44; 6PGD) was purified from Lake Van fish liver by means of affinity chromatography method. In the study at fırst fish liver was properly removed and homogenate was prepared. The homogenate was loaded onto the affinity column which was equilibrated with equilibration buffer. The column was washed with washing buffer until the absorbance value droped below 0.01 nm. Finally the elution buffer was loaded onto the column and the separated fractions of enzyme were taken as elutions. Each of the elutions was done qualitative protein determination at 280 nm, quantitative protein determination at 595 nm and activity assays at 340 nm. To check the purity of the enzyme SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) was used. The photo of the electrophoresis was taken and seen one protein band. The purification rate was calculated to be 446.5-fold. The molecular mass of the subunit was estimated to be 57000 Da by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Optimal temperature and optimal pH of the enzyme were determined between 35-40 oC and 8-9 respectively. This study which effect of ionic strenght was searched in the enzyme shown optimal activity in 0.02 M salt [(NH4)2SO4].