The Effect of Mechanical Injury on Axonal Transport and Axonal Injury Signalling Mechanisms

Abstract

Nöronların bütünlüklerini koruyabilmeleri ve normal işlevlerini yerine getirebilmeleri için gövdeden akson ve dendritlere doğru (anterograd) ve ters yönde (retrograd) sürekli bir madde taşıması gerçekleşmektedir. Nörodejeneratif hastalıklarda ve travmalar sonucunda aksonal taşıma bozulur ve bunun sonucunda aksonlar üzerinde taşınan parçaların sayısı ve taşınma hızları değişir. Akson hasarı sonucu negatif ve pozitif hasar sinyal mekanizmaları oluşmakta ve hücre gövdesine bu sinyaller taşınarak nukleus haberdar edilmektedir.Bu çalışmada, bir nöron kültürü modelinde laser ışınıyla yapılan bir akson kesisi ardından, aksonal taşımanın nasıl etkilendiği ve hasarla ilgili sinyal mekanizmalarının niteliği araştırıldı. Bunun için yetişkin fare arka kök gangliyonları ayrıştırılarak primer duyu nöron kültürü yapıldı ve in vitro ortamda bu hücrelerin aksonlarında taşınan parçaların sayısı ve hızları belirlendi. Aksonlar, laser ışığı ile hassas bir şekilde gövdeden yaklaşık 200 µm uzaklıktan kesildi ve 12 dakika süresince, gövdeden 50 µm uzaklıktaki bir noktada gerçekleşen aksonal taşıma analizleri yapıldı. Aksotomi sonrası dallanan ve dallanmayan aksonlarla ve komşu aksonlarda taşınan parçaların sayıları ve hızları tespit edildi. Diğer taraftan, aksonal taşımada rol oynayan dynein ve kinesin motor proteinleri, aksonal taşıma belirteci APP, aksonal protein tau ve hasar sinyal kompleksi oluşturan ? ve ß importinin hasar öncesi ve sonrası miktarları immünohistokimyasal olarak işaretlendi. Akson hasarı ile DR6 ve kaspaz 6 arasında bir ilişki olup olmadığı analiz edildi. Aksotomi ile nöronlarda meydana gelen hasar sinyali olarak işlev görebilecek depolarizasyon özel bir boya ile görüntülendi. Akson hasarıyla uyarılan yeni protein sentezinin aksonal taşımaya etkisi, transkripsiyon ve translasyon seviyelerinde inhibe edilerek araştırıldı.Çalışmanın sonucunda, in vitro ortamda uzayan aksonlara uygulanan aksotomiden sonra, hasar öncesine göre, retrograd olarak taşınan parçaların sayısının ve hızlarının azaldığı, diğer taraftan anterograd olarak taşınan parçaların sayısının değişmediği ancak; hızlarının azaldığı belirlenirken, komşu dal ve aksonlarda buna paralel değişikliklere rastlanmadı. Hasar sinyalinin iletilmesinde aksotomiye bağlı depolarizasyon dalgasının rol oynayabileceği ve transkripsyon seviyesinde bir düzenlemenin olabileceği tesbit edilirken; importinler, APP, tau, DR6 ve kaspaz 6 gibi bazı faktörlerle ilgili literatürde rapor edilmemiş yeni bulgulara ulaşıldı. Sonuç olarak; bu çalışma, yetişkin nöronunda mekanik hasarın aksonal taşımayı nasıl etkilediği ve hasarla ilgili sinyal mekanizmasında nelerin rol oynayabileceğine ilişkin yeni ve önemli veriler elde edilmiştir.Anahtar kelimeler: Arka kök gangliyonu, Aksonal taşıma, Hasar Sinyalleri, APP, Dynein, Kinesin, ? importin, ß importin

A continuous material transport from the soma to the axon or dendrite (anterograde) or in the opposite direction (retrograde) should occur in neurons to preserve their integrity and keep them functioning. Axonal transport is disturbed in neurodegenerative diseases and following traumas that lead to change in the number and speed of materials transported. Axonal injury also creates positive or negative signals that are transmitted to the cell body and inform the nucleus about the injury.In this study, how the axonal transport is affected by an axotomy with a laser beam in a neuronal culture model and the characteristics of signal mechanisms regarding injury were investigated. For this, primary sensory neuronal cultures were setup by dissociation of adult mouse dorsal root ganglia and the number and speed of particles transported in their outgrown axons in vitro were determined. With a laser beam, axons were cut at about 200 ? m from the soma and transport occurring at 50 ? m during 12 minutes was analysed. The number and speed of particles in branching or solitary axons or neighbouring ones were determined. Besides, pre and post axotomy levels of motor proteins dynein and kinesin, axonal injury marker APP, axonal protein tau and injury complex forming ? and ? importins were immunohistochemically analysed. A potential relationship between axonal injury and DR6 and caspase 6 was investigated. Depolarization induced by axotomy, which may act as an injury signal were visualized with a special dye. The role of new protein synthesis in disturbed axonal transport after axonal injury was analyzed by inhibition of transcription and translation.The results showed that the number and speed of retrogradely transported particles were decreased after axotomy while not the number but the speed of anterograde particles was reduced. These changes were not observed in neighbouring branches or axons. It was found that a wave of depolarization due to axotomy may act as an injury signal and a regulation at transcription level may occur. Novel findings were obtained regarding importins, APP, tau, DR6 and caspase 6. In conclusion, this study has provided new and important data about how mechanical injury affects axonal transport in adult neurons and what may play significant role in injury signalling mechanisms.Key words: Dorsal Root Ganglion, Axonal Transport, Injury Signals, APP, Dynein, Kinesin, importin ?, importin ß