Investigation of the Effect of Gentisic Acid Application on the Adipogenesis Process Through Transcription Factors

Abstract

3T3-L1 öncül adiposit hücre hattı, Swiss 3T3 fare embriyolarından elde edilmektedir ve adipogenezin transkripsiyonel düzenlenmesine yönelik çalışmalarda in vitro model olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. 3T3-L1 öncül yağ hücreleri adipojenik şartlar altında olgun yağ hücrelerine farklılaşabilmektedir. Yağ hücresi farklılaşmasının inhibisyonunu araştırmak için doğal, sentetik ve yarı-sentetik birçok maddenin etkisi incelenmiş ancak bunların çok az bir kısmı yağ hücresi farklılaşmasını istenilen düzeyde inhibe edebilmiştir. Literatürde benzoik asitin adipogenezi engellediğini gösteren bir takım çalışmalar bulunmasına rağmen benzoik asitin bir türevi olan gentisik asitin adipogenez üzerindeki etkisini araştıran çalışmalar oldukça az sayıdadır. Yaptığımız çalışma, gentisik asitin, 3T3-L1 hücrelerinin farklılaşma sürecine ve transkripsiyonel faktörlerine etkisi ölçülmüştür. Çalışmamızda öncelikle 3T3-L1 öncül yağ hücreleri çeşitli maddelerle uyarılarak olgun adipositlere farklılaşması sağlanmıştır. Hücre canlılık testinde sitotoksik etki göstermeyen 50-250 μM konsantrasyonlarındaki gentisik asit çözeltileri farklılaşmaya uğratılan 3T3-L1 hücrelerine uygulanmıştır. Farklılaşmaya uğratılmayan ve farklılaşmaya uğratılıp farklı konsantrasyonlarda gentisik asit uygulanan tüm gruplarda gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GPDH) aktivitesine, Oil Red O boyaması ile hücrelerin morfolojisine bakılmış ve hücrelerin trigliserit içerikleri spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Ayrıca transkripsiyon faktörlerinin (Peroksizom prolifere edici aktif reseptör-γ (PPAR-γ), CCAAT arttırıcı bağlayıcı protein-α (C/EBP-α) ve Sterol düzenleyici element bağlayıcı protein-1c (SREBP-1c)) düzeylerine bakılarak gentisik asitin adiposit farklılaşması üzerine olan etkisi incelenmiştir. Hücre içi trigliserid içerikleri doza bağlı düşüş göstermesine rağmen istatistiksel fark bulunamamıştır (p>0,05). Yapılan morfolojik incelemede artan konsantrasyonlarda gentisik asit uygulaması hücrelerin boyutunda ve hücre içi trigliserit depolanmasında sürekli bir azalmaya neden olmuştur. Özellikle yüksek konsantrasyonda gentisik asit uygulaması GPDH aktivitesinde düşüşe neden olmuştur (p<0,05). Yüksek konsantrasyonlardaki gentisik asit uygulamaları her üç transkripsiyon faktörünün düzeylerini de azaltmıştır (p<0,05). Tüm bu sonuçların doğrultusunda gentisik asitin yağ hücresi farklılaşmasını engellediğini söylemek mümkündür.

The 3T3-L1 precursor adipocyte cell line is derived from Swiss 3T3 mouse embryos and has been widely used as an in vitro model for the transcriptional regulation of adipogenesis. 3T3-L1 precursor adipocytes can differentiate into mature adipocytes under adipogenic conditions. In order to investigate the inhibition of fat cell differentiation, the effects of many natural, synthetic and semi-synthetic substances have been examined, but very few of them have been able to inhibit fat cell differentiation at the desired level. Although there are some studies in the literature showing that benzoic acid inhibits adipogenesis, there are very few studies investigating the effect of gentisic acid, a derivative of benzoic acid, on adipogenesis. In our study, the effect of gentisic acid on the differentiation process and transcriptional factors of 3T3-L1 cells was measured. In our study, 3T3-L1 precursor adipocytes were stimulated with various substances and differentiated into mature adipocytes. In the cell viability test, gentisic acid solutions at concentrations of 50-250 μM, which do not show cytotoxic effect, were applied to differentiated 3T3-L1 cells. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) activity, morphology of the cells was examined by Oil Red O staining and triglyceride content of the cells were measured spectrophotometrically in all undifferentiated and differentiated groups treated with gentisic acid at different concentrations. In addition, the effect of gentisic acid on adipocyte differentiation was examined by looking at the levels of transcription factors (Peroxisome proliferating active receptor-γ (PPAR-γ), CCAAT enhancer binding protein-α (C/EBP-α) and Sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c)). Although intracellular triglyceride contents showed a dose-dependent decrease, no statistical difference was found (p>0.05). In the morphological examination, gentisic acid application at increasing concentrations caused a continuous decrease in the size of the cells and intracellular triglyceride storage. Especially high concentrations of gentisic acid treatment caused a decrease in GPDH activity (p<0.05). High concentrations of gentisic acid decreased the levels of all three transcription factors (p<0.05). In the direction of all these results, it is possible to say that gentisic acid inhibits fat cell differentiation.