Cloning, Bacterial Expression, Purification and the Antiviral Effect on Zucchini Yellow Mosaic Virus (zymv) of Tritin Protein Gene Which Is Inactivating Ribosome in Wheat (triticum Aestivum L.)

Abstract

Bitki virüsleri ekonomik olarak önemli kayıplara neden olan ve etkin mücadele yöntemleri çoğunlukla olmayan patojenlerdir. Bu tez çalışması kapsamında, buğday bitkisinden rekombinant tritin proteinin elde edilmesi ve proteinin sakız kabağı (Cucurbita pepo L.) bitkisinde Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)'üne karşı antiviral aktivitesi ortaya konmaya çalışılmıştır. Ekmeklik buğday çeşidi Kutluk-94'ten izole edilen total ribonükleik asit (RNA) komplementer DNA sentezinde (cDNA) kullanılmıştır. Gen spesifik primerlerle tritin geni RT-PZR ile çoğaltılarak izole edilmiştir. Tritin geni pGEM-T Easy ve pETDuet-1 vektörüne klonlanmıştır. E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde tritin proteinin ekpresyonu sağlandıktan sonra, tritin proteini izole edilmiş ve saflaştırılmıştır. SDS-PAGE ile doğrulananan proteinin konsantrasyonu 12.56 mg/ml olarak belirlenmiştir. Sadece ZYMV uygulanan bitkilerde hastalık şiddeti %92.74 iken, 2 mg/ml tritin uygulanan bitkilerde hastalık şiddeti %46.66 olarak hesaplanmıştır. Hastalık şiddetinde azalışa neden olan tritin proteini, aynı zamanda ZYMV-CP geninin ekpresyon seviyesinde de azalışa neden olmuştur. Tritin uygulanan bitkilerde pathogenesis related gene 1 (PR1) geninin ifadesinin arttığı real time PZR ile ortaya konmuştur. Tritinin ZYMV virüsüne karşı antiviral etkisine ilaveten, morfolojik veriler farklı konsantrasyonlardaki tritin proteinin sakız kabağı bitkilerine fitotoksik etki ettiğini göstermiştir.

Plant viruses are pathogens that cause economically significant losses and often lack effective control methods. In the scope of this thesis, it was tried to obtain recombinant tritin protein from wheat plant and to reveal the antiviral activity of the protein against ZYMV virus in squash plants. Total RNA isolated from the bread wheat cultivar Kutluk-94 was used in the synthesis of complementary DNA (cDNA). Tritin gene was isolated by amplification by RT-PCR with gene specific primers. Tritin gene was cloned into pGEM-T Easy and pETDuet-1 vector. After expression of tritin protein in E. coli BL21 (DE3) cells, tritin protein was isolated and purified. The concentration of protein confirmed by SDS-PAGE was determined as 12.56 mg/ml. While the disease severity was 92.74% in plants treated with only ZYMV, the disease severity was calculated as 46.66% in plants treated with 2 mg/ml tritin. Tritin protein, which caused a decrease in disease severity, also caused a decrease in the expression level of the ZYMV-CP gene. It was demonstrated by real time PCR that the expression of pathogenesis related gene 1 (PR1) gene increased in plants treated with tritin. In addition to the antiviral effect of tritin against ZYMV virus, morphological data showed that tritin protein at different concentrations had a phytotoxic effect on squash plants.