Evaluation of Kallistatin and Some Biochemical Parameters in Rat With Experimental Liver Injury

Abstract

Kallistatin karaciğerde lipopolisakkarid kaynaklı inflamasyon sonrası ekspresyonu azaltan negatif akut faz protein olarak görev yapmaktadır. Bu çalıĢmada, farklı derecelerde karaciğer yetmezliği oluĢturulan ratlarda kallistatin düzeyleri ile karaciğerdeki hasarın dereceleri arasında iliĢkinin olup olmadığının ortaya konulması amaçlandı. Hayvan materyali olarak; Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Deney Hayvanları Üretim ve AraĢtırma Merkezi'nden temin edilen ve canlı ağırlıkları 200-400 gr arasında değiĢen 32 adet Wister Albino erkek rat kullanıldı. ÇalıĢmaya alınan 32 rat her grupta 8 rat olmak üzere kontrol (grup1, n=8 ), grup 2 (hafif, n=8), grup 3 (orta, n=8) ve grup 4 (Ģiddetli, n=8) olarak sınıflandırıldı. Ratlarda deneysel karaciğer hasarı oluĢturmak için parafin yağında çözündürülen değiĢik yüzdelik oranlarında karbon tetraklorür (CCl4) solüsyonları subkutan uygulandı. Grup 1: Sağlıklı ratlara normal beslenme programı dıĢında herhangi bir Ģey uygulanmadı ve bu gruptaki ratlar kontrol (n=8 erkek sıçan ) grubu olarak adlandırıldı. Grup 2: Bu gruptaki ratlara (n=8 erkek sıçan), % 25 CCI4 (parafin likitte çözdürülmüĢ) solüsyonu her ratta 2 ml/kg dozda, subkutan olarak haftada iki kez ve 4 hafta boyunca uygulandı. Bu gruptaki ratlar hafif derecede karaciğer bozukluğunu Ģekillendiği için hafif grup olarak adlandırıldı. Grup 3: Bu gruptaki ratlara ilk dört hafta % 25 CCI4 (parafin likitte çözdürülmüĢ) solüsyonu her ratta 2 ml/kg dozda subkutan olarak haftada iki kez ve 4 hafta boyunca uygulandı ve kalan 2 hafta % 50 CCl4 (parafin likitte çözdürülmüĢ) solüsyonu 2 ml / kg subkutan olarak 2 hafta boyunca uygulandı (toplamda 6 hafta boyunca) ve gruptaki ratlar orta grup (n=8 erkek sıçan) olarak adlandırıldı. Grup 4: bu grup için aynı grup 3 prosedürü uygulanmıĢ ve daha sonra 2 hafta boyunca parafin yağı tedavisinde 2 ml / kg % 62.5 CCl4 subkütan yoldan enjekte edildi (toplamda 8 hafta boyunca) ve bu gruptaki ratlar Ģiddetli grup (n=8 erkek sıçan) olarak adlandırıldı. ÇalıĢmanın 4. haftasında grup 2'deki, 6. haftasında grup 3'deki ve 8. Haftasında grup 4'deki ve kontrol grubundaki ratlara ksilazin 60 mg/kg ve Ketamin 7.5 mg/kg kombinasyonları kas içi uygulandı ve bu uygulamalardan 20-30 dakika sonra ratlar sakrifiye edildi. Sakrifiye edilen ratların kalbinde hemen hematolojik ve biyokimyasal analizler için antikogulantlı ve antikogulantsız tüplere kan numuneleri alındı. Hematolojik parametrelerin analizi aynı günde antikoagulantlı tüplere alınan kan örneklerinden, hematokrit değer, hemoglobin konsantrasyonu, lökosit sayısı, trombosit sayısı ve MCHC değerleri Ġç hastalıkları Anabilim dalımız laboratuvarında bulunan Veteriner Hemogram cihazı (Veterinary MS4-s- Melet Schloesing Laboratories in France) ile ölçüldü. Biyokimyasal parametrelerin ölçümü için antikuagulantsız tüplere alınan kan örnekleri 3000 devir/dk 15 dakika santrifüje edilerek serumları çıkarıldı. Elde edilen serumlar ölçümler yapılıncaya kadar -20 °C'de muhafaza edildi. Serum AST, ALT, LDH ve GGT düzeylerinin ölçümü için elde edilen serumlarda ticari kitler kullanılarak otoanalizatör (BS- 120 Vet-Mindray) cihazıyla ölçümleri yapıldı. Serum Rat Kallistatin (Katalog NO: YLA1624RA SERĠNA4, ELISA kit Ylbiont), Rat kollajen tip I (Col I, Katalog NO:YLA0195RA, ELISA kiti Ylbiont) ve Rat kollajen tip III (Col III, Katalog NO: YLA0605RA ELISA kit Ylbiont) seviyeleri ticari ELISA test kitleri kullanılarak ve test kitlerinin prosedüründe belirtildiği Ģekilde ELISA cihazıyla ölçümleri yapıldı. Hematolojik parametrelerin istatistiksel analizinde, karaciğer hasar gruplarına ait sıçanların WBC, Neu, LYM, Mon, PCT düzeyleri kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksek (p<0.05) tespit edilirken, MCH ve MCHC düzeyleri ise daha düĢük saptandı (p.<0.05). Ancak RBC, Hct ve MPV değerleri matematiksel olarak yüksek ve MCV ve Hb değerleri matematiksel olarak düĢük olmasına rağmen istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p<0.05). Biyokimyasal parametrelerin istatistiksel analizinde, serum ALT düzeylerinin analizinde; ġiddetli karaciğer hasarı olan sıçanların serum ALT düzeylerinin hafif ve orta derecede karaciğer hasarı olanlardan anlamlı derecede yüksek olduğu bulundu. Hafif ve orta Ģiddette karaciğer hasar gruplarının ALT düzeyleri kontrol grubunun ALT düzeyleri ile karĢılaĢtırıldı ve anlamlı bir fark bulunmadı. Serum AST düzeylerinin analizinde; Ģiddetli derecede karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların serum AST düzeyleri kontrol, hafif derecede ve orta derecede karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların AST düzeylerine göre anlamlı düzeyde yüksek bulunurken hafif derecede karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların AST düzeyleri ile kontrol grubunu AST düzeyleri arasındaki fark anlamlı bulunmadı. Serum GGT düzeylerinin analizinde; ġiddetli karaciğer hasarı olan sıçanların serum GGT düzeylerinin, hafif ve orta derecede karaciğer hasarı sıçanlarının GGT düzeylerinden anlamlı derecede yüksek olduğu, karaciğer hasarı grupları (hafif ve orta) ile kontrol grubu arasında anlamlı bir fark olmadığı bulundu. Serum LDH düzeylerinin analizinde; ġiddetli karaciğer hasarı olan sıçanların serum LDH seviyeleri; hafif ila orta Ģiddette karaciğer hasarı ve kontrol grubu olan sıçanların LDH düzeylerinden anlamlı derecede yüksek tespit edildi. Ayrıca hafif ve orta Ģiddette karaciğer hasarı grupları arasında anlamlı fark 73 bulunmadı. Serum kollajen-I düzeylerinin analizinde; Karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların serum kollajen-I düzeyleri kontrol grubunun kollajen-I göre önemli düzeyde yüksek tespit edildi. Benzer Ģekilde Karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların serum kollajen-III düzeyleri kontrol grubunun kollajen-III göre önemli düzeyde yüksek tespit edildi. Kallistatin düzeylerinin analizinde; serum kallistatin düzeyleri karaciğer hasarı oluĢturulan tüm gruplarda kontrol grubuna göre düĢük bulundu. Gruplar arası karĢılaĢtırmada ise Ģiddetli derecede karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların kallistatin düzeylerinin hafif derecede karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların kallistatin düzeylerine göre anlamlı düzeyde düĢük tespit edildi. Orta derecede karaciğeri hasarı oluĢturulan kallistatin düzeyleri hafif derecede karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların kallistatin düzeyleri ile arasında fark bulunmadı. Kontrol grubu ratların ile Karaciğer hasarı oluĢturulan ratlarının karaciğer organın histopatolojik incelenmesinde kontrol grubunun ratların karaciğer dokusunun histolojik görünümü normal görünümde olduğu saptanırken, karbontetra klorürle karaciğer hasarı oluĢturulan ratların karaciğer dokusunda Ģiddetli derecede morfolojik değiĢiklikler saptandı. Karaciğer organın özellikle vena centralis ve orta-zon bölgelerinde hepatositlerde hidropik dejenerasyon ve pıhtılaĢma nekrozu tespit edildi. Bazı vena centralis (Periacinary fibrosis) ve portal alanlarda fibroz yapı mevcut, ince kollajen demetlerinin portal izlerinden parankime yayılması ve aktivasyon, perisinusoidal miyofibroblastik hücrelerde de gözlendi. Karaciğer portal izlerinde ve karaciğer parankimi içinde birkaç makrofaj ile karıĢmıĢ lenfoid hücrelerin zaman zaman biriktiği gözlendi. Bu değiĢiklikler, hücrelerin ayrıĢması ve ağır CCl4 tedavi grubu sıçanlarının karaciğer parankiminde karaciğer lob mimarisinin bozulması ile sonuçlanmıĢtır. Karbontetra klorür ile değiĢik derecelerde karaciğer hasarı oluĢturulan ratların hematolojik, biyokimyasal parametreler ve karaciğer dokusunun histopatolojik incelenmesi kontrol grubuna göre değerlendiriliğinde önemli düzeyde değiĢiklikler saptandı. Karbontetra klorürle karaciğer hasarı oluĢturulan (karaciğer hasarı gruplarında) ratların karaciğer dokusundaki hasarın Ģiddeti derecede morfolojik değiĢiklikler ile kallistatin düzeyleri arasında bir iliĢkinin olduğu hem biyokimyasal hemde hematolojik parametrelerle ortaya konuldu. Sonuç olarak; Karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların kallistatin düzeylerindeki değiĢimleri ile karaciğer dokusunda oluĢan hasara paralel olarak önemli düzeyde düĢük tespit edildi. Serum kallistatin düzeylerindeki değiĢimlerin karaciğer doku hasar düzeylerinin belirlenmesinde ve karaciğer hastalıklarının tedavisinde uygulanan tedavi prognozunun değerlendirilmesinde önemli bir parametre olduğu sonucuna varılmıĢtır. Anahtar Kelimeler: Kallistatin, Karaciğer hasarı, CCl4, Biyokimyasal parametrelerinKallistatin acts as a negative acute phase protein that reduces expression after lipopolysaccharide-induced inflammation in the liver. In this study, it was aimed to determine whether there is a relationship between the levels of Kallistatin and liver damage in rats with different degrees of liver failure. The material of this study consisted of 32 Wister Albino male rats obtained from Van Yüzüncü Yıl University Experimental Animals Production and Research Center and weighing between 200-400 gr were used. Thirty-two rats were included in 8 rats in each group as to group 1 (control, n=8), group 2 (mild, n=8), group 3 (moderate, n = 8), group 4 (severe, n=8). In order to cause experimental liver damage in rats, carbon tetrachloride (CCl4) solutions of different percentages dissolved in paraffin oil were applied subcutaneously. Group 1: Healthy rats will not be treated with anything other than the normal diet. Rats in this group were named as control (n=8 male rats). Group 2: In this group (n=8 male rats), 25% CCI4 (dissolved in paraffin liquid) solution was applied to each rat at a dose of 2 ml / kg twice a week subcutaneously for 4 weeks. The rats in this group were named as mild group because of mild liver impairment. Group 3: 25% CCI4 (dissolved in paraffin liquid) solution was administered to rats in this group for 4 weeks in 2 ml / kg subcutaneously twice a week (as same as group 2) and the remaining 2 weeks were treated with 2 ml/kg of 50% CCl4 (dissolved in paraffin liquid) solution (for a total of 6 weeks) and the rats in the group were named as the middle group (n=8 male rats) (Table 6). Group 4: the same procedure of group 3 had been applied for this group then proceed with injected subcutaneously of 2 ml/kg of 62.5% CCl4 in paraffin oil treatment for the 2 weeks (on the whole 8 weeks) and this group was named as the severe group (n=8 male rats). Xylazine 60 mg / kg and Ketamine 7.5 mg / kg combinations were administered intramuscularly to rats in group 2 at the 4th week of the study, group 3 at in the sixth week of study, group 4 in the eighth week of the study and control group rats and 20-30 minutes from these applications. Then the rats were sacrificed. Blood samples were taken into anticogulant and non-anticogulant tubes for immediate hematological and biochemical analyzes in the heart of sacrified rats. Hematological parameters, hemoglobin concentration, leukocyte count, platelet count and MCHC values were measured on the same day with the Veterinary Hemogram Device (Veterinary MS4-s-Melet Schloesing Laboratories in France). Blood samples were taken into antiquagulant-free tubes for centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes. The sera obtained were stored at - 20 ° C until measurements were made. Serum AST, ALT, LDH and GGT levels were measured by autoanalyser (BS-120 Vet-Mindray) using commercial kits. Serum Rat Kallistatin (Rat Kallistan, Catalog NO: YLA1624RA SERINA4, ELISA kit Ylbiont), Rat collagen typeⅠ(Col I, Catalog NO: YLA0195RA, ELISA kit Ylbiont) and Rat collagen type III (Col III , Catalog NO: YLA0605RA ELISA kit Ylbiont ) levels were measured using commercial ELISA test kits and with the ELISA instrument as specified in the procedure of the test kits. In the statistical analysis of hematological parameters, WBC, Neu, LYM, Mon, PCT levels in liver damage groups were significantly higher than the control group (p<0.05), while MCH and MCHC levels were lower (p<0.05). Although, RBC, Hct and MPV values were found to be mathematically high, and MCV and Hb values were mathematically low, they were not statistically significant (p<0.05). In the statistical analysis of biochemical parameters, in the analysis of serum ALT levels; serum ALT levels of rats with severe liver injury were found to be significantly higher than those of mild and moderate liver injury, whereas ALT levels of mild and moderate liver injury were compared with ALT levels of control group and no significant difference was found. In the analysis of serum AST levels; serum AST levels of rats with severe liver injury were significantly higher than those of rats with mild and moderate liver injury, but there was no significant difference between AST levels of mild liver injury and AST levels of control group. In the analysis of serum GGT levels; Serum GGT levels of rats with severe liver injury were found to be significantly higher than the GGT levels of mild and moderate liver injury rats, whereas there was no significant difference between liver injury groups (mild and moderate) and control group. In the analysis of serum LDH levels; serum LDH levels of rats with severe liver injury; was significantly higher than the LDH levels of rats with mild to moderate liver injury and control group, and also there were no significant difference between mild and moderate in rats belonging to liver injury groups. In the analysis of serum Collagen-I levels; Serum Collagen-I levels of rats with liver injury were significantly higher than those of the control group. Similarly, serum Collagen-III levels of rats with liver injury were significantly higher than those of the control group. The comparison between the groups was statistically exposed a significant difference between the kallistatin levels of mild liver injury and the kallistatin levels of severe liver injury, however there was no difference was found between the kal levels 71 of moderate and severe liver injury groups. Histopathological examination of the liver organ of the liver and control group rats revealed that the liver tissue had normal histological appearance, while the liver tissue of carbontetra chloride (in rats belonging to liver injury groups) showed severe morphological changes. These findings were hydropic degeneration and coagulation necrosis was detected in hepatocytes, especially in the vena centralis and mid-zone regions. Fibrosis was present in some vena centralis (Periacinary fibrosis) and portal areas. The spread of thin collagen bundles from the portal marks to the parenchyma was observed only. Activation was also observed in pericinusoidal myofibroblastic cells. Lymphoid cells mixed with several macrophages were observed to accumulate occasionally in portal scars and liver parenchyma. These changes resulted in cell dissociation and disruption of the liver lobe architecture in the liver parenchyma of heavy CCl4 treatment group rats. When the histopathological examination of the hematological, biochemical parameters and liver tissue of rats with different degrees of liver damage were made with carbontetra chloride, significant changes were found in the control group. The relationship between the severity of liver tissue damage and the Kallistatin levels of the liver tissue of rats with carbontetra chloride (liver injury groups) was demonstrated by both biochemical and hematological parameters. As a result; Changes in the Kallistatin levels of rats with liver injury were found to be significantly low in parallel with the damage to the liver tissue. It was concluded that changes in serum kallistatin levels are an important parameter in determining liver tissue damage levels and evaluating treatment prognosis in the treatment of liver diseases. Key Words: Kallistatin, Liver injury, CCl4, Biochemical parameters