Analyising of Rna 1, Rna 2, Rna3 Apple Mosaic Virus (APMV) Malatya Isolate’s Genom With Moleculer Cloning

Abstract

Moleküler klonlama yöntemi kullanılarak Elma mozaik virüs (Apple mosaic virus, ApMV)'ü Malatya izolatının genomunda yer alan RNA1, RNA2 ve RNA3 segmentlerinin analizi gerçekleştirilmiştir. Belirtilen segmentler üzerinde rastgele seçilen bölgelere web temelli PRİMER 3 programı yardımı ile spesifik primerler dizayn edilmiştir. Dizayn edilen segment spesifik primerler ile küt uçlu DNA fragmentleri oluşturan Pfu DNA polymerase enzimi kullanılarak gerçekleştirilen RT-PCR çalışmaları sonucunda RNA 1 segmenti üzerinde 474 bp, RNA 2 segmenti üzerinde 543 bp ve RNA 3 segmenti üzerinde ise 375 bp büyüklüğünde fragmentler çoğaltılmış ve agaroz jelde görüntülenmiştir. Saflaştırılan DNA fragmentleri ticari pGEM T-Easy Vector kiti kullanılarak klonlanmıştır. DNA baz dizileri ile protein motifleri belirlenen DNA fragmentleri GU048905, GU048906 ve GU048907 erişim numaraları ile Gen Bankasına kayıtları yapılmıştır. Bilgisayar programı yardımı ile gerçekleştirilen filogenetik analiz çalışmaları sonucunda ApMV?Malatya izolatının dünyadaki diğer izolatlar ile %90-97 oranında benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir. ApMV-Malatya izolatının RT-PCR yöntemi ile teşhisinin daha iyi yapılabilmesi için oluşturulan genom spesifik primerlerden özellikle RNA2 segmenti için dizayn edilen ve 543 bp uzunluğunda fragment oluşturan primer çiftinin etmeni teşhis etmede ideal olduğu belirlenmiştir.The analysis of RNA1, RNA2 and RNA3 segments of Apple mosaic virus (ApMV) Malatya isolate were performed by using molecular cloning.Specific primers were designed by wed-based program PRİMER 3 to the randomly selected regions of the related segments. By using Pfu DNA polymerase enzyme with the ağabeylity to produce blunt ended fragments a 474 bp long amplicon on RNA1 segment, a 543 bp long amplicon on RNA2 segment and 375 bp long amplicon on RNA3 segment were generated and viewed in the agorose gel. The purified DNA fragments were cloned using the commercial pGEM T Easy Vector kit. The nucleotide sequences and protein motifs and GU048907. Phylogenetic analysis studies, performed with the computer programs, isolates previously reported in databases.Among the primer pairs designed to detect ApMV-Malatya isolate an RT-PCR primer pair was determined as the best for the detection of the isolate generating a 543 bp fragments.