Immobilization of Rhizomucor Miehei Lipase on Fibrous Support

Abstract

Bu çalışma kapsamında Rhizomucor miehei'ye ait lipaz enzimi ipliksi destek materyali üzerine çok katmanlı olarak tutuklanmıştır. Çalışmada geliştirilen lipaz tutuklama yönteminde öncelikle artı yüklü dallanmış bir polimer olan polietilenimin'in (PEI) lipazlarla elektrostatik kompleks oluşturma özelliği incelenmiştir. Destek kullanılmaksızın PEI-lipaz küreciklerinin oluşturulmasında en uygun PEI konsantrasyonu 2 mg/mL ? 0.06 mg/mL aralığında denenerek belirlenmiş, uygun PEI konsantrasyonu 0.25 mg/mL; PEI/enzim oranı ise 0.02 bulunmuştur. Bu oranda oluşturulan PEI-enzim küreciklerinin aktivitesi serbest enzimle kıyaslandığında %160 bulunmuştur. PEI-enzim komplekslerinin çapraz bağlanması için GA (Gluteraldehit) kullanılmıştır. Optimum GA miktarı 2 mg/mL olarak belirlenmiştir. GA ilavesiyle uygun bulunan PEI konsantrasyonu 0.5 mg/mL, uygun PEI/enzim oranı 0.04 olarak saptanmıştır. İpliksi destek materyali kullanıldığında ise destek üzerine PEI çözeltisi ilave edilerek destekle etkileşime bırakılmış daha sonra ortama enzim ilave edilmiştir. İpliksi materyal üzerine enzim tutuklamak üzere 0?10 mg PEI/g pamuk aralığında konsantrasyonlar denenmiştir. Kullanılması gereken uygun PEI konsantrasyonu 1.5 mg PEI/g destek, PEI/enzim oranı 0.05'dir. Ortama ilave edilmesi gereken GA oranı belirlenirken 6.25?625 mg GA/g destek aralığında GA konsantrasyonlarının etkisi incelenmiştir. Uygun GA miktarı 62.5 mg/g destek materyalidir. Serbest ve destek üzerine tutuklanmış enzimlerin sıcaklık, pH, depolama stabiliteleri ile Vmax ve Km değerleri araştırılmıştır.

Lipase form Rhizomucor miehei was immobilized on a fibrous type support. Enzyme immobilization yielded a multilayer lipase complex formation and deposition of the complexes on the fibrils of fibrous support. The method involves electrostatic complex formation between branched polyethylenemine (PEI) polymer and lipase to initiate enzyme immobilization and then cross linking of the complexes with glutaraldehyde (GA). It was found that Rhizomucor miehei lipase can form ionic complexes with PEI leading to turbid aggregates in solution without reduction in activity. It was found that PEI to lipase ratio of 1:50 was found an optimum resulting in near full complex formation of all enzymes in solution. Interestingly, PEI-lipase aggregates at the optimum ratio in solution lead to 160 % increase in lipase activity. GA cross linking of PEI-lipase aggregates resulted in an increase of PEI to lipase ratio to 1:25 leading to full complexation. When fibrous support was used, lipase immobilization procedure included adsorption of PEI to the support, lipase addition and finally GA cross linking of coated PEI-lipase aggregates on the fibrils. Various factors affecting lipase immobilization on fibrous support was investigated including PEI to lipase ratio, GA concentration. It was found that PEI to lipase ratio of 1:20 led to aggregation of total enzyme in solution on the cotton fibrils. When optimum PEI to lipase ratio and GA amount was used, 28.3 mg lipase enzyme can successfully be immobilized per gram of cotton. In this study, the stability of RM lipase under different temperature, pH and storage conditions and kinetic parameters has been investigated.