Efficacy of Bakuchiol in Corneal Alkali Injury Model in Rats

Abstract

Amaç: Bu çalışma, ratlarda korneal alkali yanık modelinde, hidrojele yüklenmiş bakuchiolün tedavi yöntemi olarak epitel defekti boyutlarına; korneal neovaskülerizasyon, korneal opaklık şiddetine; histopatolojik kesitlere, immünohistokimyasal belirteçlere (TNF-α, VEGF) olan etkilerini araştırmayı amaçlamıştır. Gereç ve Yöntem: 35 tane erkek Wistar cinsi erkek ratın sağ kornea santraline topikal ve genel anestezi altında 1 N NaOH emdirilmiş 3mm çapındaki filte kağıdının 30 saniye süre ile yerleştirilmesi ile korneal alkali yanık oluşturuldu. Randomize edilen ratlar 5 gruba ayrıldı (kontrol, visco, steroid, 250 IU/g bakuchiol yüklü visco ve 500 IU/g bakuchiol yüklü visco). Tüm gruplara enfeksiyon riskine karşı 12 saat arayla günde 2 defa siprofloksasin içeren göz damlası uygulaması yapıldı. Kontrol grubu antibiyotik dışı tedavi almadı. Visco grubuna günde 4 defa oftalmik hidrojel uygulaması yapıldı. Steroid grubuna günde 4 defa deksametazon içeren göz damlası uygulaması yapıldı. 250 IU/g bakuchiol yüklü visco ve 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grupları belirtilen dozlarda Bakuchiol yüklemesi yapılmış oftalmik hidrojel uygulamaları günde 4 defa yapıldı. Ratlar 0, 3, 7 ve 14. günler intraperitoneal ketamin genel anestezisi altında stero mikroskop ile muayene edilip fotoğraflandı. 14.gün yüksek doz inteperitoneal genel anestezi altında ratlar dekapitasyon ile sakrifiye edildi. Enükleasyon işlemi gerçekleştirilek gözler %10'luk formol ile sabitlendi. Histopatolojik değerlendirmeler Hematoksilen-Eozin boyama ile yapıldı. İmmünohistokimyasal değerlendirmeler TNF Alfa ve VEGF antikorları ile boyama ile yapıldı. Bulgular: 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu ile kontrol, Visco grubu ve Steroid grubu arasında Muayeneye Dayanıklı Korneal Vaskulerizasyon Oran ortalamalarında anlamlı fark vardı (p<0,05), Kontrol grubu ile 250 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu arasında da Muayeneye Dayanıklı Korneal Vaskulerizasyon Oran ortalamalarında anlamlı fark vardı (p<0,05). Diğer gruplar arası Muayeneye Dayanıklı Korneal Vaskülerizasyon ran ortalamalarında anlamlı fark gözlenmedi (p>0,05) fakat oransal olarak en düşük korneal neovaskülerizasyon oranına sahip gubunun 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu olduğu görüldü, onu sırasıyla 250 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu, steroid grubu, visco grubu ve konrol grubu takip etti. Kontrol grubu ile 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu arasında Kornea Opaklık Skor ortalaması bakımından anlamlı fark var iken (p<0,05), diğer gruplar arası Kornea Opaklık Skor ortalamalarında anlamlı fark gözlenmedi (p>0,05) fakat oransal olarak en düşük korneal opaklık ortalamasına sahip gubunun 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu olduğu görüldü, onu sırasıyla 250 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu, steroid grubu=visco grubu ve konrol grubu takip etti. Gruplara göre ratlarda '3. Gün Kornea Epitel Defekti Yüzdesi' ortalamaları arasında anlamlı fark gözlendi (p†=0.004). Steroid grubu ile visco grubu ve 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu arasında Kornea Epitel Defekti Yüzdesi ortalaması bakımından anlamlı fark vardı (p<0,05). Diğer gruplar arası Kornea Epitel Defekti Yüzdesi ortalamalarında anlamlı fark gözlenmedi (p>0,05). 3.gün kornea epitel defekti ortalamasının steriod grubunda en yüksek olduğu bunu sırasıyla 250 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu ve kontrol grubunun takip ettiği gözlemlendi. 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu ve visco grubunda 3. günde epitel defektinin tamamen kapanmış olduğu görüldü. 7. Gün ve 14. Gün Kornea Epitel Defekti Yüzdesi tüm guruplardaki ratlarda sıfır idi. Gruplara göre ratlarda, 'Epitel Nekroz Skor, Inflamatuar Hücre Yoğunluk Skor' ortalamaları arasında anlamlı fark gözlenmedi (p†=0.09, p†=0.1). Gruplara göre ratlarda Kornea Hemoraji Skoru ortalamaları arasında anlamlı fark gözlendi (p†=0.04). Kontrol grubu ile 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu arasında Kornea Hemoraji Skor ortalamaları arasında anlamlı fark var (p<0,05) iken diğer gruplar arası Kornea Hemoraji Skor ortalamalarında anlamlı fark gözlenmedi (p>0,05). En az korneal hemoraji izlenen grup 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubuydu. Onu sırasıyla 250 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu, steroid grubu, visco grubu ve kontrol grubu izledi. Gruplara göre ratlarda Stromal Ödem Skoru ortalamaları arasında anlamlı fark gözlendi (p†=0.008). Visco grubu ile 250 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu ve 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu arasında Stromal Ödem Skor ortalamaları arasında anlamlı fark var (p<0,05) iken diğer gruplar arası Stromal Ödem Skor ortalamalarında anlamlı fark gözlenmedi (p>0,05). En az stromal ödem izlenen grup 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubuydu. Onu sırasıyla 250 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu, steroid grubu, kontrol grubu ve visco grubu izledi. Bu bulgular bakuchiolün stromal ödemi azaltma konusunda doza bağlı artan bir etkisi olduğunu düşündürmektedir. Gruplara göre ratlarda TNF Alfa Boyanma Skor ortalamaları arasında anlamlı fark gözlenmedi (p†=0.08) fakat en düşük TNF Alfa skoru alan grup 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubuydu. Onu sırasıyla steroid grubu, kontrol grubu, 250 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu ve visco grubu takip etti. Gruplara göre ratlarda VEGF Boyama Skoru ortalamaları arasında anlamlı fark gözlendi (p†=0,002). Kontrol grubu ile 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu arasında VEGF Boyama Skor ortalamaları arasında anlamlı fark var (p<0,05), Visco grubu ile Steroid grubu, 250 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu ve 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu arasında da VEGF Boyama Skor ortalamaları arasında anlamlı fark var (p<0,05) iken diğer gruplar arası VEGF Boyama Skor ortalamalarında anlamlı fark gözlenmedi (p>0,05). En düşük VEGF skoru alan grup 500 IU/g bakuchiol yüklü visco grubuydu. Onu sırasıyla 250 IU/g bakuchiol yüklü visco grubu, steroid grubu, kontrol grubu ve visco grubu takip etti. Sonuç: Bakuchiol korneal alkali yaralanmalarda, kornea vaskülerizasyonunu, korneal skar oluşumunu engelleme; korneal hemorajiyi ve stromal ödemi azaltma konusunda doza bağlı artan bir etki göstermiştir ve klasik tedavinin bir parçası olan steroidden daha etkili olmuştur. Verilerimiz hidrojele yüklü bakuchiolün anti TNF alfa ve anti VEGF etkilerinin topikal steroidden daha etkili olduğunu göstermektedir. Gerek bakuchiolün tanımlanmış organ koruyucu etkileri gerek antienflamatuvar etkileri bakuchiolün bu olumlu sonuçları almamıza sebep olan mekanizmaları aktive etmiş olabilir. Mekanizmanın tam olarak anlaşılabilmesi için moleküler düzeyde daha detaylı çalışmalar yapmak gerekmektedir. Bakuchiolün korneal kimyasal yaralanmaların tedavisinde etkili bir tedavi yöntemi olabileceğini düşünmekteyiz. Doz ayarlaması, uygulama zamanı ve uygulama tekniği açısından ileri preklinik ve klinik çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Anahtar kelimeler: Bakuchiol, korneal alkali yaralanma, VEGF, TNF Alfa, hidrojelObjective: This study aimed to investigate the effects of hydrogel-loaded bakuchiol as a therapeutic method on epithelial defect sizes; corneal neovascularization, corneal opacity severity; histopathological sections, and immunohistochemical markers (TNF-α, VEGF) in a corneal alkali burn model in rats. Materials and Methods: A corneal alkali burn was created in the central cornea of 35 male Wistar rats by placing a 3mm diameter filter paper soaked in 1 N NaOH for 30 seconds under topical and general anesthesia. The randomized rats were divided into 5 groups (control, visco, steroid, visco loaded with 250 IU/g bakuchiol, and visco loaded with 500 IU/g bakuchiol). All groups received eye drops containing ciprofloxacin every 12 hours for infection prevention. The control group received no antibiotic treatment. The visco group received ophthalmic hydrogel application four times a day. The steroid group received eye drops containing dexamethasone four times a day. The groups with 250 IU/g and 500 IU/g bakuchiol loaded visco received ophthalmic hydrogel applications at the specified doses four times a day. Rats were examined and photographed on days 0, 3, 7, and 14 under intraperitoneal ketamine general anesthesia using a slit lamp microscope. On day 14, rats were sacrificed under high-dose intraperitoneal general anesthesia through decapitation. Enucleation was performed, and the eyes were fixed in 10% formalin. Histopathological evaluations were conducted using Hematoxylin-Eosin staining. Immunohistochemical evaluations were conducted using TNF Alpha and VEGF antibodies. Results: Significant differences were observed in the Mean Resistant Corneal Vascularization Ratios between the 500 IU/g bakuchiol-loaded visco group and the control, visco, and steroid groups (p<0,05). Significant differences were also observed between the control group and the 250 IU/g bakuchiol-loaded visco group (p<0,05). The 500 IU/g bakuchiol-loaded visco group had the lowest corneal neovascularization ratio followed by the 250 IU/g bakuchiol-loaded visco group, steroid group, visco group, and control group, respectively. Significant differences were observed in the Corneal Opacity Score between the control group and the 500 IU/g bakuchiol-loaded visco group (p<0,05). The 500 IU/g bakuchiol-loaded visco group had the lowest corneal opacity average followed by the 250 IU/g bakuchiol loaded visco group, steroid group-visco group, and control group, respectively. Significant differences were observed in the '3rd Day Corneal Epithelial Defect Percentage' averages among groups (p†=0.004). The highest epithelial defect was observed in the steroid group on the 3rd day, followed by the 250 IU/g bakuchiol loaded visco group and the control group. The 500 IU/g bakuchiol-loaded visco group and the visco group showed completely closed epithelial defects on the 3rd day. The Corneal Epithelial Defect Percentage was zero in all groups on days 7 and 14. Conclusion: Bakuchiol demonstrated a dose-dependent increasing effect on reducing corneal vascularization, preventing corneal scar formation, and reducing corneal hemorrhage and stromal edema in corneal alkali injuries. It was more effective than steroids, a part of classical treatment. Our data suggest that hydrogel loaded bakuchiol has more effective anti-TNF alpha and anti-VEGF effects than topical steroids. Both the defined organ-protective effects and anti-inflammatory effects of bakuchiol might have activated the mechanisms leading to these positive results. Further detailed studies at the molecular level are required to fully understand the mechanism. We believe bakuchiol could be an effective treatment method for corneal chemical injuries. Advanced preclinical and clinical studies are needed for dose adjustment, application timing, and application technique. Keywords: Bakuchiol, corneal alkali injury, VEGF, TNF Alpha, hydrogel