Sensitive Detection of Prunus Necrotic Ringspot Virus (PNRSV) by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and Comparison of the Sensitiveness With ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Test

Abstract

İki farklı teşhis yönteminin (DAS-ELISA ve RT-PCR) odunsu konukçu Prunus mahalefe transfer edilen Malatya izolatı Prunus necrotic ringspot virüsünü (PNRSV) teşhisindeki başansının karşılaştırmalı analizi gerçekleştirilmiştir. RT- PCR testi için total RNA ekstraksiyonu, silika temelli metoda göre taze yaprak, kök, kabuk ve yeşil sürgün kabuğu dokuları kullanarak gerçekleştirilmiştir. Saflaştınlan RNA, reverz transkripsiyonda cDNA sentezi için kalıp olarak kullanılmıştır. İki farklı primer seti kullanılarak gerçekleştirilen RT-PCR testi sonrasında 616 bp ve 785 bp uzunluğunda çoğaltılan PCR ürünleri, agaroz jel'de koşulmuş ve ethidium bromid ile boyanarak gözlemlenmiştir. ELISA testi ile karşılaştırıldığında PNRSV izolaunı tamda RT-PCR'm daha duyarlı olduğu saptanmıştır. PNRSV izolatmı RT- PCR ile tamda, kullanılacak en iyi dokuyu belirlemek için yapılan çalışmada kök, kabuk ve yeşil sürgün kabuğu dokularına nazaran yaprak dokusunun PNRSV'yi saptamada en iyi bitkisel doku olduğu tespit edilmiştir. PNRSV virüsünün RT-PCR ile tanısında PCR bileşenlerinin reaksiyona olan etkileri araştırılmış ve herbir bileşen için optimum konsantrasyonlar veya miktarlar tespit edilmiştir. Elli mikrolitte hacminde gerçekleştirilen PCR reaksiyonunda en iyi magnezyum kloriir konsantrasyonun 1.25-2.5 mM aralığında, en iyi dNTP konsantrasyonun 1-10 mM aralığında, en iyi Taq DNA polimeraz enzim konsantrasyonun 0.0625-2 ünite/ul aralığında, en iyi primer konsantrasyonun ise 0.2-0.0002 pmol/ul aralığında olduğu tespit edilmiştir. Aynı hacimde gerçekleştirilen PCR reaksiyonunda en iyi cDNA miktarının 1.6-4 ul aralığında olduğu saptanmıştır. PNRSV virüsünün RT-PCR yöntemi ile tanısında elde edilen optimize bileşen konsantrasyonları iklim odası ve arazi koşullarında gelişen infekteli bitkilere uygulandığında virüsün rahat ve güvenilir biçimde tanısının yapılabileceği tespit edilmiştir. Anahtar kelimeler: PNRSV, RT-PCR, DAS-ELISA, karşılaştırma, optimizasyon

Two methods (DAS-ELISA-RT-PCR) were compared in detection of PNRSV-Malatya isolate from a woody host P. mahaleb. Silica based method was used in total RNA extraction from leaf, root, one year old green bark tissue and bark tissues. Purified RNA was served as template in reverse transcription for complementary DNA (cDNA) synthesis. Two expected size of fragments (616bp and 785bp) of two different primer sets were visualized in agarose gel when staining ethidium bromide solution. RT-PCR was found to be more sensitive detection method comparing ELISA test in detecting PNRSV. Leaf tissue was proved to be more suitable tissue in detection of virus by RT-PCR respect to root, one-year-old green bark tissue and bark tissue. To obtain detailed understanding of various factors influencing the RT-PCR in detection of PNRSV, parameters were optimized. Using a PNRSV isolate with a pair of primer, magnesium chloride, dNTP, primer, Tag DNA polymerase enzyme and cDNA the followings were found: The magnesium chloride concentration should be 1.25-2.250 mM, the dNTP concentration should be 1-10 mM, the primer concentration should be 0.2-0.0002 pmol/ul and the Tag DNA polymerase enzyme concentration should be 0.0625-2 unit/ul and cDNA value should be 1.6-4 ul for 50 fj.1 rection volume. When using optimised values, a clear and reliable detection was performed from growing and field grown PNRSV infected plants. Key words: PNRSV, RT-PCR, DAS-ELISA, comparison, optimization. Ill