Investigation of Antiatherogenic and Antiinflammatory Activity of Betulinic Acid Applied Prophylactically and Therapeutically in Human Umbilical Vein Endothelial Cells Induced by Tumour Necrosis Factor Alpha

Abstract

Endotel hasarı sonrasında görülen lokal enflamasyon, aterosklerozun başlangıcıdır ve sadece başlangıçta değil, hastalığın her aşamasında enflamasyon önemli bir role sahiptir. Endotel hücresinin aktive olmasının ardından sitokinler, kemokinler ve adezyon molekülleri salgılanmaya başlamaktadır. Çeşitli fitokimyasallar ile monosit adezyonunu ve hücre hasarını azaltmak üzerine yapılan çalışmalarda; hücre içi adhezyon molekülü-1 (ICAM-1), vasküler hücre adhezyon molekülü-1 (VCAM-1) ve nükleer faktör kappa B (NF-κB) gibi moleküllerin düzeylerinde azalma olabileceği gösterilmiştir. İnsan umbilikal ven endotelyal hücrelerini (HUVEC) TNF-α ile indüklemek iyi bir koroner arter hastalığı modeli oluşturmaktadır. Bu çalışmada tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α) ile indüklenip enflamasyon ve ateroskleroz modeli oluşturulan HUVEC hücre hattında, yüksek antienflamatuvar etkiye sahip olan betulinik asitin, antienflamatuvar ve anti-aterosklerotik etkinliğinin biyokimyasal düzeyde araştırılması ve hedeflenmektedir. HUVEC hücre hattı TNF-α ile indüklenip enflamasyon ve ateroskleroz modeli oluşturulan insan umbilikal ven endotelyal hücre kültüründe, 10 ng/mL dozunda TNF-α uygulamasının 6 saat öncesinde, 10 ng/mL TNF-α uygulaması ile eş zamanlı ve 10 ng/mL TNF-α uygulamasından 6 saat sonra olmak üzere her gruba betulinik asitin LD50 konsantrasyonu uygulanmıştır. Toplamda 24 saat inkübasyondan sonra endotel hücrelerindeki nitrik oksit, TNF-α, interlökin 1-beta (IL-1β), IL-10, ICAM-1, VCAM-1 ve NF-κB düzeyleri ELISAmetrik olarak ölçülmüştür. Analizler SPSS for Windows v22.0 paket programında yapılmıştır. TNF-α uygulanan grupta, nitrik oksit, TNF-α, IL-1β, ICAM-1, VCAM-1 ve NF-κB düzeyleri artmıştır (p<0.05). TNF-α uygulanan gruba kıyasla, betulinik asit uygulanan her üç grupta da bu parametreler açısından istatistiksel olarak anlamlı düşüş gözlemlendi (p<0.05). IL-10 düzeyi ise TNF-α uygulanmasıyla değişiklik göstermemiş (p>0.05) ancak TNF-α ile birlikte betulinik asit uygulanmasıyla artış göstermiştir (p<0.05). TNF-α uygulamasının HUVEC hücrelerinde enflamatuvar parametrelerinin seviyelerini arttırması, endotel hasarı modelinin oluştuğunu göstermektedir. TNF-α ile birlikte betulinik asit uygulanmasının enflamatuvar parametrelerinin seviyelerini azaltması betulinik asitin, enflamasyon ve endotel hasarı gelişimi üzerine terapötik ve proflaktik etkisinin olabileceğini göstermektedir.Local inflammation after endothelial damage is the beginning of atherosclerosis and inflammation has an important role not only at the beginning but at every stage of the disease. After activation of the endothelial cell, cytokines, chemokines and adhesion molecules are secreted. In studies conducted to reduce monocyte adhesion and cell damage with various phytochemicals, it has been shown that the levels of molecules such as intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and nuclear factor kappa B (NF-κB) may decrease. Induction of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) with TNF-α constitutes a good model of coronary artery disease. In this study, we aimed to investigate the anti-inflammatory and anti-atherosclerotic activity of betulinic acid, which has a high anti-inflammatory effect, at the biochemical level in the HUVEC cell line induced with tumour necrosis factor-alpha (TNF-α) and created inflammation and atherosclerosis model. In human umbilical vein endothelial cell culture in which HUVEC cell line was induced with TNF-α and inflammation and atherosclerosis model was created, LD50 concentration of betulinic acid was administered to each group 6 hours before, simultaneously with and 6 hours after 10 ng/mL TNF-α administration. Nitric oxide, TNF-α, interleukin 1-beta (IL-1β), IL-10, ICAM-1, VCAM-1 and NF-κB levels in endothelial cells were measured ELISAmetrically after 24 hours' incubation. Analyses were performed using SPSS for Windows v22.0 package programme. Nitric oxide, TNF-α, IL-1β, ICAM-1, VCAM-1 and NF-κB levels increased in the TNF-α treated group (p<0.05). A statistically significant decrease in these parameters was observed in all three groups treated with betulinic acid compared to the TNF-α-treated group (p<0.05). IL-10 level did not change with TNF-α treatment (p>0.05) but increased with TNF-α and betulinic acid treatment (p<0.05). TNF-α administration increased the levels of inflammatory parameters in HUVEC cells, indicating that an endothelial damage model was formed. The decrease in the levels of inflammatory parameters with TNF-α and betulinic acid administration suggests that betulinic acid may have therapeutic and prophylactic effects on inflammation and endothelial damage development.