Bakteriyemi Tanısında Hızlı İdentifikasyon ve Duyarlılık Test Yöntemlerinin Değerlendirilmesi

Abstract

Kan dolaşımı enfeksiyonları, özellikle hastane ortamında ciddi morbidite ve mortaliteye yol açan kritik bir sorundur. Sepsisli hastalarda hayatta kalma şansını artırmak için tedaviye ideal olarak ilk saat içinde başlanması gerekirken, geleneksel kültür yöntemleri hedefe yönelik tedaviyi 48-72 saat geciktirmektedir. Bu çalışmanın amacı, bu hayati tanısal gecikmeyi aşmak için geliştirilen multipleks PCR (hızlı etken tanısı) ve Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi (HADT) yöntemlerinin laboratuvar performansını, mevcut rutin uygulamalarla karşılaştırarak değerlendirmektir. Bu çalışma, Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nda 01.09.2024–31.05.2025 tarihleri arasında pozitif üreme sinyali saptanan 50 farklı hastanın kan kültüründen elde edilen 50 izolat ile yürütülmüştür. Pozitif kan kültür şişeleri gram boyama ile ön sonuç raporlaması için incelenmiş, eş zamanlı olarak katı besiyerlerine ekim yapılmıştır. İzolatların tür tanımlaması otomatize sistem (Phoenix M50) kullanılarak ve antibiyotik duyarlılık testleri ise disk difüzyon yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Etkenlerin ve direnç genlerinin tespiti için multipleks PCR (Bio-Speedy Sepsis qPCR MX-30L Panel) yöntemi de kullanılmıştır. HADT yöntemi, pozitif kan kültürü şişesinden doğrudan 125±25 µl seyreltilmemiş kan alınarak Mueller Hinton agar plağına inokülasyon yapılması ve 4, 6, 8 ve 16-20 saatlerde EUCAST HADT sınır değerleri dikkate alınarak sonuçların okunması ilkesine dayanmıştır. Referans yöntem olarak disk difüzyon yöntemi kullanılmıştır. İncelenen 50 izolatın dağılımında en sık rastlanan türler Staphylococcus aureus n: 15 (%30), Klebsiella pneumoniae n: 11 (%22) ve Pseudomonas aeruginosa n:11 (%22) olmuştur. Otomatize sistem (cins ve tür tanımlaması için) ve disk difüzyon yöntemi (direnç profili için) referans yöntem kabul edilerek PCR sonuçları ile karşılaştırıldığında; çalışılan 50 izolatın 49'unda (%98) cins, 46'sında (%92) tür ve 43'ünde (%86) direnç geni düzeyinde tutarlılık saptanmıştır. Toplamda 40 izolat (%80) tüm parametrelerde tam uyum gösterirken, 10 izolatta (%20) kısmi uyum gözlenmiştir. HADT sonuçlarında, disklerin okunabilirlik oranları inkübasyon süresi ile artmış; 4. saatte %86,90, 6. ve 8. saatlerde %96,89 ve 16-20. saatte %100 olarak saptanmıştır. Yöntemin kategorik uyum oranları tüm saatlerde yüksek bulunmuştur: 4. saatte %96,86, 6. saatte %96,24, 8. saatte %96,97 ve 16-20. saatte %98,43 olarak bulunmuştur. Çalışmada 4., 6., 8. ve 16-20. saatlerde saptanan çok büyük hata oranları sırasıyla %0,63, %0,39, %0,72, %0,71 olarak, büyük hata oranları sırasıyla %5,79, %7,48, %3,33, %1,42 olarak, küçük hata oranları ise sırasıyla %0,00, %0,23, %0,46, %0,22 olarak bulunmuştur. Multipleks PCR (hızlı tanı) ve HADT'nin birlikte kullanımı, antibiyogram süresini 32-48 saat kısaltarak hedefe yönelik tedaviye geçişi hızlandırmaktadır. EUCAST HADT sınır değerlerinin nihai sonuçlarla yüksek uyum göstermesi, bu erken değerlendirmenin güvenilir olduğunu kanıtlamıştır. Bu yaklaşım, hasta morbidite/mortalitesini azaltma ve antimikrobiyal direnci kontrol altına almada kritik bir potansiyele sahiptir. Anahtar kelimeler: Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi (HADT), bakteriyemi, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

Bloodstream infections are a critical issue that leads to serious morbidity and mortality, especially in hospital settings. While treatment should ideally begin within the first hour to increase the chances of survival in patients with sepsis, traditional culture methods delay targeted treatment by 48-72 hours. The aim of this study is to evaluate the laboratory performance of multiplex PCR (rapid pathogen diagnosis) and Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing (RAST) methods, developed to overcome this critical diagnostic delay, by comparing them with current routine practices. This study was conducted with 50 isolates obtained from 50 different patients with positive blood cultures at the Van Yüzüncü Yıl University Medical Microbiology Laboratory between 01.09.2024 and 31.05.2025. Positive blood culture bottles were examined by gram staining for preliminary reporting and simultaneously subcultured onto solid media. Species identification was performed using an automated system (Phoenix M50) and antimicrobial susceptibility testing was conducted using the disk diffusion method. A multiplex PCR (Bio-Speedy Sepsis qPCR MX-30L Panel) method was also used to detect pathogens and resistance genes. The RAST method involved inoculating 125±25 µl of undiluted blood directly from positive blood culture bottles onto Mueller-Hinton agar, with results read at 4, 6, 8, and 16-20 hours according to EUCAST RAST breakpoints. The standard disk diffusion method served as the reference method. Among the 50 isolates examined, the most frequently encountered species were Staphylococcus aureus n=15 (30%), Klebsiella pneumoniae n=11 (22%), and Pseudomonas aeruginosa n=11 (22%). When PCR results were compared using the automated system (for genus and species identification) and the disk diffusion method (for resistance profile) as reference methods, consistency was detected in 49 (98%) of the 50 isolates at the genus level, 46 (92%) at the species level, and 43 (86%) at the resistance gene level. While 40 isolates (80%) showed full concordance across all parameters, partial concordance was observed in 10 isolates (20%). Regarding the RAST results, disk readability rates increased with incubation time, reaching 86.90% at the 4th hour, 96.89% at the 6th and 8th hours, and 100% at the 16th-20th hours. The categorical agreement rates of the method were found to be high at all time points: 96.86% at the 4th hour, 96.24% at the 6th hour, 96.97% at the 8th hour, and 98.43% at the 16th-20th hours. In the study, very major error rates at the 4th, 6th, 8th, and 16th-20th hours were found to be 0.63%, 0.39%, 0.72%, and 0.71%, respectively; major error rates were 5.79%, 7.48%, 3.33%, and 1.42%, respectively; and minor error rates were 0.00%, 0.23%, 0.46%, and 0.22%, respectively. The combined use of multiplex PCR (rapid diagnosis) and HADT shortens the time to antibiotic susceptibility testing by 32-48 hours, accelerating the transition to targeted treatment. The high concordance between EUCAST HADT breakpoints and final results demonstrates the reliability of this early assessment. This approach has critical potential for reducing patient morbidity/mortality and controlling antimicrobial resistance. Keywords: Rapid Antimicrobial Susceptibility Test (RAST), bacteremia, Polymerase Chain Reaction (PCR)