The Effect of Thymoquinone on Expression Levels of Apoptotic, Oxidative and Antioxidant Genes in Nrk-52e Cells

Abstract

Nigella sativa'nın aktif bileşeni olan timokinon (TQ), antioksidan ve anti-inflamatuar özellikleri başta olmak üzere pek çok yararlı etkiye sahiptir. Bu tez çalışması, pek çok yararlı etkisi son yıllarda yapılan bilimsel alışmalarla ortaya konulan yararlı etkileri pek çok araştırmada ortaya konulan timokinonun (TQ), böbrek hücrelerindeki apoptotik ve oksidatif yolaklar üzerine etkilerinin, doz ve zamana bağlı olarak gösterilmesi ve amacıyla planlanmıştır. Bu amaçla, Çalışmada materyal olarak, NRK-52E (ATCC® CRL-1571™) sıçan böbrek epitel hücre serisi kullanıldı. NRK-52E hücreleri in vitro koşullarda uygun ortamda sistemli olarak pasajları yapılarak üremesi sağlandı. TQ'un 24. ve 48. saatlerdeki IC50 değerinin tespit edilmesi için MTT hücre canlılık testi yapıldı. Çalışmada uygulanması gereken proliferatif (TQp-10µM)) ve toksik (TQIC50-60µM) dozları tespit edildi. Bu dozların 24 ve 48. saatte elde edilen örneklerde apoptotik(CASP3 (kaspaz 3), CASP8 (kaspaz 8), CASP9 (kaspaz 9), BAX (BCL2 ile X), BCL2 (BCL2 apoptozis düzenleyici) ve antioksidan (GPX1 (glutatyon peroksidaz 1), SOD1 (süperoksit dismutaz 1), oksidatif (NCF1 (nötrofilsistolik faktör 1)) gen ekspresyonları RT-qPCR ile yapıldı. Katlanma Değişimi 2^(-delta delta CT) formülü kullanılarak bulundu. Bu analiz sonuçlarına göre; Kontrol gen ile karşılaştırıldığında, TQ proliferatif dozunda 24. saatte GPX1, TQIC50 dozunda SOD1 önemli oranda up-regule oldu. Oksidatif NCF1 geni 24. saatte doza bağlı olarak değişmediği görüldü. Apoptotik genlerin 24. saatte her iki dozda sınırlı up regüle olduğu saptandı. GPX1 TQp dozunda 48. saatte up-regule olurken (7,215 kat), SOD1, TQIC50 dozunda up-regule (3,623 kat) oldu. NCF1 genin ise 48. saatte yüksek dozda önemli oranda up-regule olduğu belirlendi. Apoptotik genler, 48. saatte TQp dozunda sınırlı miktarda up-regule olurken, TQIC50 dozunda bütün genlerin önemli oranda up-regüle oldukları ortaya konuldu. Sonuç olarak, bu tez çalışmasında, 24. saatte GPx, TQIC50 dozunda ise SOD1'in önemli oranda up regüle olduğu, NCF genin önemli oranda değişmediği, 48 saatte toksik dozda oksidatif stresin arttığı ve SOD'un antioksidan olarak kullanıldığı, TQ bağımlı hücre ölümünde apoptotik yolak etkisinin 24. saatte sınırlı olduğu, 48. saatte toksik dozda hücre ölümünde dış yolak üzerinden gerçekleştiği ortaya konuldu.

Thymoquinone (TQ), the activeingredient of Nigella sativa, has many beneficial effects, especially its antioxidant and anti-inflammatory properties. Thymoquinone (TQ), the active component of Nigella sativa, has many beneficial effects, especially its antioxidant and anti-inflammatory properties. This thesis study was planned to demonstrate the effects of TQ on apoptotic and oxidative pathways in kidney cells, depending on dose and time. For this purpose, NRK-52E (ATCC® CRL-1571™) rat kidney epithelial cell line was used as material in the study. NRK-52E cells were produced by systematically passage of cells in an appropriate medium under in vitro conditions. MTT cell viability test was performed to determine the IC50 value of TQ at 24th and 48th hours. the proliferative (TQp-10µM) and toxic (TQIC50-60µM) doses to be administered in the study were determined. In samples of these doses obtained at 24 and 48 hours, apoptotic CASP3 (caspase 3), CASP8 (caspase 8), CASP9 (caspase 9), BAX (BCL2 associated X), BCL2 (BCL2 apoptosis regulator) and oxidative (GPX1 (glutathione peroxidase 1)), SOD1 (superoxide dismutase 1), NCF1 (neutrophil cytosolic factor 1) gene expressions were performed by RT-qPCR. The Fold Change was found using the formula 2^(-delta delta CT). According to the results of this analysis, Compared to the control gene, GPX1 at 24 hours at the TQ proliferative dose was significantly up-regulated at the TQIC50 dose. It was observed that the oxidative NCF1 gene did not change depending on the dose at the 24th hour. Apoptotic genes were found to be limited up-regulated at both doses at 24 hours. GPX1 was up-regulated (7,215-fold) at the TQp dose at the 48th hour, while SOD1 was up-regulated (3,623-fold) at the TQIC50 dose. It was determined that NCF1 gene was significantly up-regulated at high dose at 48th hour. While apoptotic genes were up-regulated to a limited extent at the TQp dose at 48th hours, all genes were found to be significantly up-regulated at the TQIC50 dose. In conclusion, in this thesis study, it was found that GPx was upregulated at the 24th hour and SOD1 was significantly upregulated at the TQIC50 dose, the NCF gene did not change significantly, the oxidative stress increased at the toxic dose in the 48th hour, and SOD was used as an antioxidant. It was revealed that the effect of apoptotic pathway in TQ-dependent cell death was limited at the 24th hour, and that cell death at toxic dose occurred via the external pathway at the 48th hour.